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黃曲霉毒素B1（AFB1）酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明

方法編號(hào)：CDC-5511

本測(cè)試盒用間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法定量測(cè)定谷物中AFB₁。該測(cè)試盒反應(yīng)孔可拆卸，可測(cè)單份樣品，也可測(cè)多份樣品。定量分析時(shí)需有含450nm波長(zhǎng)的微孔板酶標(biāo)儀。

1 概要

黃曲霉毒素是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、花生、堅(jiān)果等。天然污染的黃曲霉毒素以AFB₁為主，AFB₁屬于強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，肝臟是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。

AFB₁檢測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和ELISA方法，本試劑盒是以應(yīng)用單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)糧谷類(lèi)和花生及飼料中的AFB₁。

2 測(cè)定原理

本試劑盒采用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行測(cè)定。用抗原包被微孔板，加入AFB₁標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、抗AFB₁單克隆抗體進(jìn)行孵育后，將未與包被抗原結(jié)合的抗體洗去；再加入酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經(jīng)過(guò)終止液終止后，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定OD值。

3 提供的物品

----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB₁-BSA

----5個(gè)濃度的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液（各0.5mL）

標(biāo)準(zhǔn)1：0ng/mL…………………………………………………………….直接使用

標(biāo)準(zhǔn)2：0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用

標(biāo)準(zhǔn)3：0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用

標(biāo)準(zhǔn)4：0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用

標(biāo)準(zhǔn)5：1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

----抗AF B₁單克隆抗體溶液（6mL）……………………………………………直接使用

----酶標(biāo)物（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----顯色液（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----終止液（6mL）…………………………………………………………………直接使用

----濃縮洗液（30mL）..……………………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

----微孔板酶標(biāo)儀（可于450nm處測(cè)定）、振蕩器、粉碎機(jī)、微量移液器

----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙

----氯化鈉（分析純）、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水

5 操作者注意事項(xiàng)

       ----標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有黃曲霉毒素，應(yīng)特別小心。

----使用過(guò)的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡過(guò)夜。

----終止液含有硫（此處空白）酸，避免接觸皮膚。

----每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

----每步加樣時(shí)間應(yīng)控制在5min內(nèi)。

----孵育過(guò)程中應(yīng)避光。

----不要使用過(guò)期試劑盒。

       ----不要交叉使用不同批號(hào)的試劑盒中的試劑。

6 儲(chǔ)存條件

       ----保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍.

       ----顯色液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

       ----將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質(zhì)的標(biāo)志

       ----標(biāo)準(zhǔn)1的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8 樣品處理

----樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存。

----取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液。

----強(qiáng)力振蕩3分鐘。

----用快速定性濾紙過(guò)濾。

----取1mL濾液，加水4mL進(jìn)行稀釋。

----取50μL稀釋液進(jìn)行分析。

----*根據(jù)需要可以增減樣品量，但甲醇-水溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增減。

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時(shí)與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

----取所需數(shù)量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次。

----加入50mL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔，記錄樣品及標(biāo)準(zhǔn)的位置，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗體溶液到每個(gè)微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入酶標(biāo)物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育10~12min。

    ----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準(zhǔn)確量取。

10 樣品濃度計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD值的比值為縱坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD的比值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為AFB₁濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中AFB₁濃度C（ng/mL），按下列公式計(jì)算出樣品中AFB₁含量：

AFB₁含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀釋后樣品提取液中AFB₁含量（ng/mL）

            K：樣品稀釋倍數(shù)（按照本說(shuō)明書(shū)中樣品處理程序方法為25）

11試劑盒主要技術(shù)指標(biāo)及參數(shù)

測(cè)試盒zui低檢出濃度0.1ng/mL，回收率70%~120%，與AFB₂的交叉反應(yīng)系數(shù)小于1%，與AFG₁的交叉反應(yīng)系數(shù)為4.65%，與AFG₂交叉反應(yīng)系數(shù)小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍0.1~1.0ng/mL，試劑盒條內(nèi)變異＜10%，條間變異＜15%。

附圖（僅供參考）

                            AFB₁毒素濃度對(duì)數(shù)（ng/mL）